铜调控蛋白CopC探究

第1章铜调控体系及铜蛋白家族

1.1铜在生物体内的必要性和毒性2

1.1.1铜在生物体内的必要性2

1.1.2铜的氧化损伤3

1.2铜稳态机理4

1.2.1细胞对铜的吸收4

1.2.2细胞内铜离子的运输载体6

1.3革兰氏阴性菌的铜抑制体系8

1.4Cop家族9

1.4.1CopC溶液结构10

1.4.2CopC晶体结构及铜配位情况14

参考文献19

第2章突变体MCopC的构建、表达、纯化

2.1MCopC的构建26

2.1.1基因体外定点突变主要方法及原理26

2.1.2MCopC的构建29

2.2MCopC的诱导、表达33

2.2.1诱导表达33

2.2.2菌体的破碎33

2.2.3蛋白浓度测定(考马氏亮蓝G250测定法)33

2.3MCopC的纯化33

2.3.1离子交换柱层析原理33

2.3.2DE-52纤维素阴离子交换树脂的处理34

2.3.3洗脱34

2.3.4凝胶柱层析原理35

2.4MCopC的检验35

2.4.1TriGly SDSPAGE分析35

2.4.2紫外谱的测定36

2.4.3凝胶色谱及质谱分析38

2.5结论39

参考文献39

第3章CopC色氨酸残基的特性

3.1CopC的荧光特征42

3.1.1不同激发波长下的CopC荧光42

3.1.2突变CopC的荧光42

3.1.3异于Burstein分类的蛋白44

3.1.4CopC晶体结构中色氨酸的位置44

3.2酪氨酸和色氨酸间的能量转移45

3.3色氨酸在CopC中所处的环境47

3.4色氨酸突变对蛋白性质的影响48

3.4.1色氨酸突变对Cu(Ⅱ)结合能力的影响48

3.4.2色氨酸突变对构象影响51

3.4.3色氨酸突变对蛋白热稳定性的影响52

3.5结论54

参考文献55

第4章CopC稳定性

4.1GuHCl引起的CopC变性58

4.2两态模型60

4.2.1光谱参数变化60

4.2.2荧光相位图61

4.2.3铜结合能力变化62

4.3CopC和CopCCu(Ⅱ)稳定化能计算63

4.4解折叠动力学64

4.5其他影响因素67

4.5.1pH影响67

4.5.2温度的影响68

4.6结论69

参考文献70

第5章萘胺类化合物对CopC构象的干扰

5.1TNS对CopC构象的干扰74

5.1.1TNS对CopC构象的干扰74

5.1.2TNS与CopC间的作用力78

5.1.3机理推测80

5.2α-NA对CopC构象的干扰81

5.2.1α-NA对CopC构象的干扰81

5.2.2NA与CopC作用机理84

5.3结论86

参考文献86

第6章CopC在Cu(Ⅱ)转运中的作用

6.1MCopC与CopC-Cu(Ⅱ)反应常数90

6.2MCopC与CopC-Cu(Ⅱ)反应热力学92

6.3MCopC与CopC-Cu(Ⅱ)反应动力学93

6.4反应机理95

6.4.1CopC-Cu(Ⅱ)与EDTA的反应96

6.4.2CopC-Cu(Ⅱ)与CDTA的反应97

6.4.3CopC-Cu(Ⅱ)与MCopC的反应98

6.5结论101

参考文献102

第7章CopC中Cu(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)位点协同性

7.1两位点协同性106

7.2结论110

参考文献110

第8章CopC与Au(Ⅲ)离子的作用

8.1CopC与Au(Ⅲ)相互作用112

8.1.1Au(Ⅲ)引起CopC荧光猝灭112

8.1.2电势变化113

8.1.3Au(Ⅲ)与CopC的结合常数114

8.1.4Au(Ⅲ)催化抗坏血酸氧化受CopC的影响118

8.2Au(Ⅲ)结合对CopC构象的影响119

8.3结论121

参考文献121

第9章铜在配合物与CopC间的转运

9.1铜配合物\\[Cu(SA)(Phen)Cl·H2O］124

9.1.1铜配合物\\[Cu(SA)(Phen)Cl·H2O\\]结构124

9.1.2配合物光谱特征126

9.1.3配合物与EDTA的反应128

9.2铜配合物\\[Cu(SA)(Phen)Cl·H2O\\]与CopC的反应129

9.2.1光谱研究129

9.2.2循环伏安分析132

9.3结论133

参考文献133

缩略语134